Physical-chemical properties and cytotoxicity analysis of 5 different endodontic sealers / Propriedades físico-químicas e análise da citotoxicidade de 5 diferentes cimentos endodônticos

The aim of this study was to analyze the radiopacity, setting time, flowability, pH, calcium ion release, solubility and cytotoxicity of bioceramic cements Totalfill BC Sealer and Totalfill BC RRM, and compare them with AH Plus, MTA Fillapex and MTA Angelus. The groups were divided and compared among them according to the filling and retro-filling cement functions. Totalfill BC Sealer was compared with AH Plus and MTA Fillapex; and Totalfill BC RRM retrofilling cement with MTA Angelus. For radiopacity analysis, specimens were placed in metal rings measuring 10x1 mm placed on occlusal film together with the aluminum scale. Digora 1.51 software was used to evaluate the digitized images and determine radiographic density. Setting time was tested in accordance with the American Society for Testing and Materials C266-08 standard specifications, but specimens were fabricated in accordance with the International Organization for Standardization 6876: 2001. Flow was tested in accordance with ANSI/ADA No.57/200 specifications. In total 30 acrylic teeth were filled with filling-cements and 20, with (retrograde cavity) retro-filling cements. All teeth were immersed in ultrapure water for pH and calcium ion release measurement (atomic absorption spectrophotometer) for time intervals of 1, 3, 24, 72, 168 and 360 hours. Solubility was tested by scanning and digitizing 50 acrylic teeth twice by Micro- CT, before and after immersion in ultrapure water for time intervals of 168, 360 and 720 hours. The images were reconstructed and volume (mm3) values of samples obtained by means of CTan software (CTan v1.11.10.0, SkyScan). The in vitro effects on cells were analyzed at concentrations of 100, 50, 10, 5, 1 mg/mL, and 0 mg / mLnegative control group and recorded in time intervals of 24, 48 and 72 hours by MTT reduction assay. The results were statistically analyzed by the ANOVA, Tukey, Kruskal-Wallis and Dunn tests (P<0.05). All radiopacity values according to ISO 6876/2001, AH Plus (7.86 mm Al) being the most radiopaque followed by Totalfill BC Sealer (4.84 mm Al), MTA Fillapex (3.41 mm Al), Totalfill BC RRM (6.8 mm Al), and MTA Angelus (6.7 mm Al). The following values were the initial and final setting time (in hours), respectively: AH Plus (8 and 15); Totalfill BC Sealer (11 and 24); MTA Fillapex (13 and 26); MTA Angelus (10 and 120 minutes) and Totalfill BC RRM (3 hours and 22 hours). In flow analysis, the cements behaved as follows: MTA Fillapex (47 mm), Totalfill BC Sealer (41.5 mm), Totalfill BC RRM (33.5 mm), AH Plus (33 mm) e MTA Angelus (17.5 mm) (p < 0.05). pH analysis showed in general the lowest values for AH Plus cement, followed by Totalfill BC RRM, MTA Angelus, MTA Fillapex and Totalfill BC Sealer. AH Plus showed the highest Ca2+ release in time interval 1 hour (1.38 mg/L); MTA Fillapex, in 360 hours (3.81 mg/L); MTA Angelus, 1 hour (1.38 mg/L); Totalfill BC Sealer, 360 hours (6.77 mg/L) and Totalfill BC RRM, 360 hours (3.81 mg/L). Almost all the sealers presented solubility lower than 3% in all periods, as recommended by ISO 6876/2001. Whereas, the MTA Fillapex solubility value was higher than 5% in all periods. Relative to cytotoxicity, all the cements were shown to be toxic at the concentration of 100 mg/mL, however, Totalfill BC Sealer and Totalfill BC RRM showed the best cell viability result compared with the other cements tested. We concluded that all root canal filling and root retro-filling complied with the requisites of radiopacity, setting time, flow, pH, calcium ion release, solubility and cytotoxicity. With the exception of the MTA Fillapex that not only fulfilled the requirement of solubility. Of the sealers, Totalfill BC Sealer was outstanding: it showed the highest pH and Ca2+ release, and lowest cytotoxicity. Among the retrofilling cements, Totalfill BC RRM maintained its high pH, higher Ca2+ release, and lower cytotoxicity. (AU)

O objetivo do presente estudo foi analisar a radiopacidade, tempo de presa, escoamento, pH, liberação de íons cálcio, solubilidade e citotoxicidade dos cimentos biocerâmicos Totalfill BC Sealer e Totalfill BC RRM e compará-los ao AH Plus, MTA Fillapex e MTA Angelus. Os grupos foram divididos e comparados entre si de acordo com as funções dos cimentos de obturação e retro-obturação. Comparamos o cimento obturador Totalfill BC Sealer com os cimentos AH Plus e MTA Filapex, e o cimento retrobturador Totalfill BC RRM com o cimento retrobturador MTA Angelus. Para análise da radiopacidade, os espécimes foram colocados em anéis metálicos medindo 10x1 mm, dispostos sobre um filme oclusal com uma escala de alumínio. O software Digora 1.51 foi utilizado para avaliar as imagens digitalizadas e determinar a densidade radiográfica. O tempo de presa foi realizado de acordo com as especificações da American Society for Testing and Materials C266-08 standard specifications, mas os espécimes foram feitos de acordo com a International Organization for Standardization 6876: 2001. O escoamento foi realizado de acordo com as especificações ANSI/ADA N0 57/2000. Trinta dentes acrílicos foram preenchidos com cimentos obturadores e vinte dentes de acrílico (com cavidade retrógrada) foram preenchidos com cimentos retro-obturadores e imersos em água ultrapura para mensuração do pH e liberação de íons cálcio (espectrofotômetro de absorção atômica) no período de 1, 3, 24, 72, 168 e 360 horas. Para o teste de solubilidade, foram escaneados 50 dentes acrílicos e digitalizados duas vezes pelo Micro-CT, antes e após a imersão em água ultrapura nos períodos de 168, 360 e 720 horas. As imagens foram reconstruídas e o volume (mm3) das amostras foi obtido usando o software CTan (CTan v1.11.10.0, SkyScan). Os efeitos celulares in vitro foram analisados nas concentrações de 100, 50, 10, 5, 1 mg/mL e 0 mg / mLgrupo controle negativo e registados nos períodos de 24, 48 e 72 horas através do ensaio de redução de MTT. Os resultados foram analisados estatisticamente pelos testes ANOVA, Tukey, Kruskal-Wallis e Dunn (p < 0.05). Todos os valores de radiopacidade estavam de acordo com a norma ISO 6876/2001, sendo o AH Plus (7.86 mm Al) o mais radiopaco seguido dos demais cimentos; Totalfill BC Sealer (4.84 mm Al), MTA Filapex (3.41 mm Al), Totalfill BC RRM (6,8 mm Al), MTA Angelus (6,7 mm Al). Os valores obtidos para o tempo de presa inicial e final foram respectivamente, AH Plus (8 e 15 horas), Totalfill BC Sealer (11 e 24 horas), MTA Filapex (13 e 26 horas), Totalfill BC RRM (3 horas e 22 horas) e MTA Angelus (10 e 120 minutos). Na análise de escoamento os cimentos se comportaram da seguinte forma: AH Plus (33 mm), MTA Filapex (47 mm), Totalfill BC Sealer (41,5 mm), Totalfill BC RRM (33,5 mm), e MTA Angelus (17,5 mm) (p < 0.05). A análise do pH mostrou que o cimento AH Plus de um modo geral, foi o que apresentou os menores valores, seguido do Totalfill BC RRM, MTA Angelus, MTA Filapex e Totalfill BC Sealer. A maior liberação de Ca2+ do AH Plus foi no período de 1 hora (1.38 mg/L), MTA Filapex foi em 360 horas (3.81 mg/L), Totalfill BC Sealer 360 horas (6.77 mg/L), Totalfill BC RRM 360 horas (3.81 mg/L) e MTA Angelus em 1 hora (1.38 mg/L). Todos os cimentos apresentaram solubilidade menor que 3% em todos os períodos, como recomendado pela ISO 6876/2001. Entretanto, os valores de solubilidade do MTA Fillapex excedeu mais que 5% em todos os períodos. Com relação à citotoxicidade, todos os cimentos mostraram-se tóxicos na concentração de 100 mg/mL, porém o Totalfill BC Sealer e Totalfill BC RRM apresentaram melhor resultado de viabilidade celular comparado aos demais cimentos testados. Concluiu-se que os cimentos de obturação e retro-obturação cumpriram os requisitos de radiopacidade, tempo de presa, escomento, pH, liberação de íons cálcio, solubilidade e citotoxicidade. Com exceção do MTA Fillapex que não cumpriu somente o requisito de solubilidade. Dos cimentos obturadores, o que melhor se portou foi o Totalfill BC Sealer, apresentando maior pH e liberação de íons cálcio e menor citotoxicidade. Dentre os cimentos retro-obturadores, Totalfill BC RRM foi o que melhor se destacou, mantendo seu pH elevado, possuindo maior liberação de Ca2+ e menor citotoxicidade. (AU)

In vitro culture of ovine mammary gland cells expressing beta-lactoglobulin and beta-casein / Células da glândula mamária ovina cultivadas in vitro expressam beta-lactoglobulina e beta-caseina

The expression of milk proteins in vitro is essential to exploit the mammary gland cells as a biological model. Enzymatic tissue disaggregation has been widely used to establish mammary cell culture, but its effect in long-term ovine mammary cell culture is not completely elucidated. This study aimed at comparing mechanical/enzymatic and mechanical dissociation methods to establish ovine mammary cell culture. We compared cellular differentiation induced by lactating ewe serum or fetal bovine serum based on the gene expression levels of milk proteins (beta-lactoglobulin, alpha s1-casein, and betacasein). Mechanically dissociated cells were positive immunostaining for cytokeratin 8.13, such as mammary epithelial cells. These cells are responsible for milk protein expression and they are low immunostaining for vimentin, mesenchymal marker. Mechanical/enzymatic dissociation cells were positive for vimentin. The fastest cell growth (cell/hour) was observed in the mechanical dissociation group cultured with 10% fetal bovine serum medium. Mechanically and mechanically/enzymatically derived cells were able to express beta-casein and beta-lactoglobulin, but not alpha s1-casein. The relative expression of beta-lactoglobulin was not affected by the tissue dissociation method or culture media, beta-casein relative expression was down regulated in mechanically dissociated cells cultured in the presence of lactating ewe serum, (P = 0.019). Beta-casein relative expression was also down regulated in mechanically/enzymatically dissociated cells cultured with fetal bovine serum (P = 0.021). In the present conditions, we conclude that mechanical dissociation followed by culture with 10% of fetal bovine serum was the most efficient method to induce milk proteins' mRNA expression by ovine mammary epithelial cells in vitro.(AU)

A expressão in vitro de proteínas do leite é essencial para explorar as células da glândula mamária como um modelo biológico. A desagregação tecidual via enzimática é amplamente utilizada para o estabelecimento cultivo de células mamárias. No entanto, seu efeito a longo prazo no cultivo de células da glândula mamária ovina ainda não é bem elucidado. Este estudo tem como objetivo comparar dois métodos de dissociação tecidual, mecânico/enzimático e mecânico, para estabelecer cultivo celular de glândula mamária ovina. A indução da diferenciação celular, por adição de soro de ovelha lactante ou soro fetal bovino, foi avaliada pelos níveis de expressão de proteínas do leite (beta-lactoglobulina, alpha s1-caseína e beta-caseína). Células mecanicamente dissociadas foram positivamente marcadas para a presença de citoqueratina 8.13, marcador para células epiteliais mamárias. Essas células são as responsáveis pela produção das proteínas do leite e são pouco marcadas para a presença de vimentina, marcador para células de origem mesenquimal. Já as células obtidas da dissociação mecânica/ enzimática foram positivamente marcadas para presença de vimentina. A maior velocidade de crescimento (células/hora) foi observado para o grupo com dissociação mecânica cultivado em meio com 10% de soro fetal bovino. As células obtidas tanto da dissociação mecânica quanto mecânica/enzimática foram capazes de expressar beta-lactoglobulina e beta-caseína, mas não alfa s1-caseína. A expressão relativa de beta-lactoglobulina não foi afetada pelo método de dissociação ou meio de cultivo. A expressão relativa da beta-caseína foi negativamente regulada para células mecanicamente dissociadas e cultivadas na presença de soro de ovelha lactante (P = 0,019). A expressão relativa da beta-caseína também foi negativamente regulada para células dissociadas de forma mecânica/enzimática e cultivadas com soro fetal bovino (P = 0,021). Nas condições do presente estudo, concluímos que o método de dissociação mecânica seguido pelo cultivo em meio com 10% de soro fetal bovino foi o método mais eficiente para induzir a expressão mRNA de proteínas do leite por células epiteliais mamárias ovinas in vitro.(AU)

Análise comparativa dos cimentos MTA cinza e branco associados ao álcool isopropílico / Comparative analysis of gray and white MTA associated with isopropyl alcohol

O objetivo deste estudo ex vivo foi investigar e comparar os efeitos antibacterianos, a citotoxicidade, a adaptação marginal e a capacidade seladora do agregado trióxido mineral (MTA), branco e cinza (Angelus, Londrina, Brasil), quando combinados com água destilada ou álcool isopropílico. Os efeitos antibacterianos de ambas as formulações foram avaliados através do teste de difusão em agar utilizando Staphylococcus aureus (ATCC25923) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853) para a seleção da concentração de escolha. A geração das espécies reativas do oxigênio (ERO) foi analisada, primeiramente, utilizando cepas de Escherichia coli proficiente (AB1157) e triplo mutante (BW535), deficiente nos mecanismos de reparo. A geração de ERO também foi analisada através da degradação plasmidial (método de eletroforese) e com a utilização da sonda DCF. A geração das espécies reativas do nitrogênio (ERN) foi avaliada através da sonda DAF. A citotoxicidade dos eluatos dos cimentos foi avaliada pelo MTT, com células L929. A adaptação marginal foi feita através da microscopia eletrônica de varredura (MEV). A capacidade seladora foi realizada através de ensaios de infiltração bacteriana. Os resultados mostraram que a incorporação do isopropanol ao MTA aumentou os halos de inibição no modelo Gram-positivo (S. aureus-ATCC25923) (P <0.05). A adição de isopropanol 70% aos cimentos de MTA branco e cinza aumentou a atividade antimicrobiana para E. coli selvagem (AB1157) e triplo mutante (BW535) (P <0.0001). Não ocorreu a total degradação do DNA plasmidial para as amostras de MTA branco e cinza manipuladas com isopropanol 70%. As amostras de MTA branco e cinza manipuladas de acordo com o fabricante geraram significativamente mais espécies reativas do oxigênio (sonda DCF) (P <0.0001 e P =0.0002) e do nitrogênio (sonda DAF) (P =0.0002 e P =0.0003) do que as manipuladas com isopropanol 70%. Os cimentos manipulados com água destilada foram mais citotóxicos do que a associação com solução de isopropanol 70% (P <0.05). A análise ao MEV mostrou melhor adaptação ao preparo nas amostras com o isopropanol 70%, entretanto o ensaio de infiltração bacteriana ex vivo com Enterococcus faecalis (ATCC29212), não mostrou diferença estatística para as amostras manipuladas com isopropanol ou com água (P >0.05). Podemos concluir que a manipulação com isopropanol melhorou a atividade antimicrobiana do MTA tornando-o menos citotóxico, sem alterar a capacidade seladora.

The aim of this study was to investigate and compare the antibacterial effects, cytotoxicity, marginal adaptation and sealing ability of mineral trioxide aggregate (MTA), white and gray (Angelus, Londrina, Brasil), when combined with distilled water or isopropyl alcohol. The antibacterial effects of both formulations were evaluated by agar diffusion method using Staphylococcus aureus (ATCC25923) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853) for selecting the suitable concentration of isopropyl alcohol. The antimicrobial mechanism by the generation of reactive oxygen species (ROS) was first analyzed using Escherichia coli strains: proficient (AB1157) and triple mutant (BW535), deficient in the repair mechanisms. The ROS generation was also analyzed by degradation of DNA plasmid (electrophoresis method) and with the DCF probe. The generation of reactive nitrogen species (RNS) was assessed by DAF probe. The cytotoxicity of the eluates was assessed by MTT test, with L929 cells. The marginal adaptation was evaluated by scanning electron microscopy (SEM). The sealing ability was performed using bacterial leakage assay. The results showed that the incorporation of isopropanol to MTA increased the inhibitory haloes in Gram-positive model (S. aureus-ATCC25923) (P <0.05). Adding 70% isopropanol to white and gray MTA cements increased antimicrobial activity against both E. coli wild (AB1157) and triple-mutant (BW535) strains (P <0.0001). The DNA plasmid was not completely degraded for the samples of white and gray MTA manipulated with 70% isopropanol. The white and gray MTA samples, handled according to the manufacturer, generated significantly more ROS (DCF probe) (P <0.0001 e P =0.0002) and RNS (DAF probe) (P =0.0002 e P =0.0003) than that manipulated with 70% isopropanol. The cements handled with distilled water were more cytotoxic than when associated with isopropanol solution 70% (P <0.05). The SEM analysis showed better adaptation to the cavity prepares when the samples were filled with MTA with 70% isopropanol, however the ex vivo bacterial infiltration test with Enterococcus faecalis (ATCC29212), was not statistically different from samples manipulated with isopropanol or water (P >0.05). We can conclude that the manipulation with isopropanol improved the antimicrobial activity of the MTA rendering less citotoxicity, without altering the sealing ability.